mRNA技术作为一种新兴的生物技术，展示了巨大的应用潜力。从mRNA疫苗到mRNA药物，这一技术为疾病的预防与治疗提供了创新思路。然而，mRNA技术的发展并非一帆风顺，其面临的最大挑战之一是副产物双链RNA（dsRNA）的形成。dsRNA作为一种免疫刺激分子，会引起机体的免疫反应，进而影响mRNA的安全性和有效性。因此，如何减少dsRNA的生成，成为mRNA技术领域亟待解决的关键问题。

传统解决方案通常依赖繁琐的纯化工艺，但此类方法成本高、效率低，且难以彻底清除微量的dsRNA。T7RNA聚合酶（T7RNAP）作为mRNA体外转录（IVT）的核心工具，其天然活性（如末端转移酶与RNA依赖的RNA聚合酶活性）被认为是dsRNA形成的关键因素。因此，通过定向进化或理性设计改造T7RNAP已成为全球科研团队争相研究的热点。

2024年3月3日，我们团队在FEBS Journal上发表了题为《Engineered T7 RNA polymerase reduces dsRNA formation by lowering terminal transferase and RNA-dependent RNA polymerase activities》的研究论文。我们成功通过工程化改造T7RNAP，显著降低了体外转录过程中dsRNA的生成量（仅为野生型的18%），并大幅提升了合成mRNA的整体效率与质量，推动了基因治疗和疫苗开发领域的跨越式发展。

通过结合定向进化与半理性设计的方法，我们创新性地筛选出多个高效低毒的T7RNAP突变体，这些突变体在减少dsRNA形成方面表现出色。我们构建了随机突变库，设计了一种可实时监测液滴内RNA产物完整性与dsRNA含量的分子信标探针系统，并利用荧光激活液滴分选（FADS）技术进行超高通量筛选。最终，我们筛选出关键候选突变体Mut1（V214A）和Mut7（F162S/A247T），其产生的dsRNA含量显著低于野生型。

同时，我们采用半理性设计方法，构建了十个单点饱和突变库，并利用微孔板筛选技术来识别有益突变体。其中，微孔板筛选中使用了双探针，增加的5’-end探针用于检测RNA产量。在筛选超过1000个突变体后，我们发现关键候选突变体Mut11（K180E）和Mut14（A70Q）产生的dsRNA含量显著低于野生型，且未影响转录效率。

为了进一步优化，我们针对上述突变位点构建了DNA重组文库，最终通过微孔板筛选获得组合突变体M17（A70Q/F162S/K180E）。实验数据显示，M17的dsRNA含量仅为野生型的18%，在筛选体系中仅为0.007ng/μg。该结果不仅在体外实验中得到了验证，还在细胞实验中表现出显著的免疫原性降低与蛋白翻译效率的提升。将突变体转录的mRNA导入RAW264.7细胞后，最优突变体M11产物引发的干扰素β（IFN-β）mRNA和蛋白表达量仅为野生型的97%和1293pg/mL。诱导EGFP表达的HEK293细胞中，突变体mRNA的表达细胞数显著增加，且荧光强度稳定。这表明，减少dsRNA能够有效解除PKR介导的翻译抑制，释放mRNA的治疗潜能。

为了深入探讨突变体降低dsRNA的机制，我们通过计算机模拟与功能实验揭示了其降低dsRNA含量的原因在于减少了RNA依赖的RNA聚合酶（RDRP）活性及末端转移酶活性，这一发现为未来T7RNAP的进一步优化提供了重要理论依据。

本研究为T7RNAP的改造提供了新的方法与思路，也为mRNA技术的发展注入了新活力。通过减少dsRNA的生成，我们有效提升了mRNA的质量与安全性。基于这一研究成果，我们成功推出了一款大幅降dsRNA含量的GMP级T7RNAP产品（Cat#10629，CleascripT7RNAPolymerase GMP-grade (low dsRNA, 250U/μL)）。该产品在mRNA疫苗与mRNA药物等领域展现出广泛的应用潜力，有望进一步推动mRNA技术的蓬勃发展，为生物医学领域带来更多可能性。想了解全文或申请产品试用？扫描下方二维码即可咨询！

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